analisis instrumen Anca

Kata Pengantar Puji syukur kita panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena atas limpahan rahmat & hidayah-Nya sehinggga Makalah tentang “Pembagian Kromatografi” ini dapat terselesaikan. Kami juga mengucapkan banyak terima kasih bagi seluruh pihak yang telah membantu dalam pembuatan makalah ini, khususnya selaku pembimbing Mata Kuliah Analisis Instrumen yang senantiasa memberikan bimbingan dan masukan serta tak lupa pula kami ucapkan terimah kasih kepada teman-teman kelompok yang telah banyak membantu dalam penyelesaian makalah serta masukan yang telah diberikan selama ini. Kami menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari kesempuraan. Oleh karena itu, segala masukan & kritikan sangat kami harapkan. Semoga makalah ini dapat memberikan manfaat kepada berbagai pihak, khususnya dalam rangka pengembangan ilmu pengetahuan. Makassar, Januari 2013 Penulis   Daftar Isi Kata Pengantar....................................................................................................................... Daftar Isi................................................................................................................................ BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang..................................................................................................... B. Rumusan masalah................................................................................................. C. Tujuan................................................................................................................... BAB II PEMBAHASAN KROMATOGRAFI CAIR................................................................................................. A. KROMATOGRAFI CAIR BERPERFORMA TINGGI..................................... B. SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY.................................................... C. REVERSE PHASE CHROMATOGRAPHY..................................................... BAB III PENUTUP A. Kesimpulan........................................................................................................... B. Saran..................................................................................................................... DAFTAR PUSTAKA............................................................................................................   BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Kromatografi adalah suatu nama yang diberikan untuk teknik pemisahan tertentu. Cara yang asli telah diketengahkan pada tahun 1903 oleh TSWEET yang digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa yang berwarna, dan nama kromatografi diambil dari senyawa yang berwarna. Meskipun demikian pembatasan untuk senyawa-senyawa yang berwarna tak lama, dan sekarang hamper kebanyakan pemisahan secara kromatografi digunakan juga untuk senyawa-senyawa yang tak berwarna, termasuk gas. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fasa yaitu satu fasa tetap (stationary) dan yang lain fasa bergerak (mobile). Pemisahan-pemisahan tergantung pada gerakan relative pada dua fasa ini. Fasa tetap dapat berupa zat padat atau cair. Jika fasa tetap berupa zat padat maka cara tersebut dikenal dengan nama kromatografi serapan. Jika fasa tetap berupa zat cair maka cara tersebut dikenal dengan nama kromatografi partisi. Sedangkan fasa bergerak dapat berupa zat cair atau gas. Berbagai jenis pemisahan yang sederhana dengan kromatografi kertas telah dikerjakan dimana prosesnya dikenal sebagai “analisis kapiler”. Metode-metode seperti ini sangat bersesuaian dengan kromatografi serapan, dan sekarang kromatografi kertas dipandang sebagai perkembangan dari system partisi. Salah satu zat padat dapat digunakan untuk menyokong fasa tetap yaitu bubuk selulosa. B. Rumusan Masalah a. Apa yang dimaksud dengan HPLC (High Performance Liquid Cromatograph) ? b. Apa yang dimaksud dengn Size Exclusion Chromatography ? c. Apa yang dimaksud dengan Reverse Phase Chromatography ? C. Tujuan Agar mahasiswa mampu menjelaskan dan memahami berbagai macam kromatografi cair. BAB II PEMBAHASAN KROMATOGRAFI CAIR (LIQUID CHROMATOGRAPHIY) Kromatografi cair (LC) adalah teknik pemisahan di mana fase gerak adalah cairan. kromatografi cair dapat dilakukan baik dalam kolom atau pesawat. kromatografi cair hari kini yang umumnya menggunakan kemasan partikel kecil yang sangat dan tekanan yang relatif tinggi disebut sebagai kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). Dalam teknik HPLC, sampel dipaksa melalui kolom yang dikemas dengan fase diam terdiri dari tidak teratur atau partikel berbentuk bola, sebuah lapisan monolitik berpori , atau membran berpori oleh a) cairan mobile (fase pada tekanan tinggi. HPLC secara historis dibagi menjadi dua kelas yang berbeda-sub berdasarkan polaritas fase gerak dan diam. Metode di mana fase diam lebih polar dari fase gerak (misalnya toluena sebagai fase gerak, silika sebagai fase diam) ini disebut kromatografi fasa normal cair (NPLC) dan campuran air-metanol berlawanan (misalnya sebagai fase gerak dan C18 = octadecylsilyl sebagai fase diam) adalah terbalik disebut kromatografi fase cair (RPLC). Ironisnya “fase normal” memiliki aplikasi yang lebih sedikit dan RPLC karena itu digunakan jauh lebih. Teknik khusus yang datang di bawah ini luas pos yang tercantum di bawah ini. Ini juga perlu dicatat bahwa teknik berikut ini juga dapat dianggap cair kromatografi protein cepat jika tekanan tidak ada digunakan untuk menggerakkan fase mobile melalui fase diam. Kromatografi cair merupakan teknik yang tepat untuk memisahkan ion atau molekul yang terlarut dalam suatu larutan. Jika larutan sampel berinteraksi dengan fase stasioner, maka molekul-molekul didalamnya berinteraksi dengan fase stasioner; namun interaksinya berbeda dikarenakan perbedaan daya serap (adsorption), pertukaran ion (ion exchange), partisi (partitioning), atau ukuran. Perbedaan ini membuat komponen terpisah satu dengan yang lain dan dapat dilihat perbedaannya dari lamanya waktu transit komponen tersebut melewati kolom.[3] Terdapat beberapa jenis kromatografi cair, diantaranya: reverse phase chromatography, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), size exclusion chromatography, serta supercritical fluid chromatography. A. KROMATOGRAFI CAIR BERPERFORMA TINGGI Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fase cair dan zat padatnya merupakan fase diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fase diam tertentu dan fase gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa. HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik. SISTEM PERALATAN HPLC Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.   Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini : 1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik. 2. Pompa Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan. 3. Tempat penyuntikan sampel Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal. Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel 4. Kolom dan Fase diam Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni: • Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit). • Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa. • Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis. Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3] Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan. 5. Detektor HPLC Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: • Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel. • Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil. • Stabil dalam pengopersiannya. • Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. • Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier). • Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak. Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor seperti berikut : Detektor Sensitifitas (g/ml) Kisaran linier Karakteristik Absorbansi Uv-vis Fotometer filter Spektrofotometer spektrometer photo-diode array 5 x 10-10 5 x 10-10 > 2 x 10-10 104 105 105 Sensitivitas bagus, paling sering digunakan, selektif terhadap gugus-gugus dan struktur-struktur yang tidak jenuh. Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat bagus, selektif, Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak. Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal akan tetapi sensitivitasnya sedang. Sangat sensitif terhadap suhu, dan tidak dapat digunakan pada elusi bergradien Elektrokimia Konduktimetri Amperometri 10-8 10-12 104 105 Peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak, tidak dapat digunakan pada elusi bergradien. Hanya mendeteksi solut-solut ionik. Sensitifitas sangat bagus, selektif tetapi timbul masalah dengan adanya kontaminasi elektroda. JENIS HPLC Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut: 1. Kromatografi Adsorbsi Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor. 2. Kromatografi fase terikat Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat. 3. Kromatografi penukar ion KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin. 4. Kromatografi Pasangan ion Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. 5. KromatogrSafi Eksklusi Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain. 6. Kromatografi Afinitas Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks. DERIVATISASI PADA HPLC Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada HPLC adalah untuk: 1. Meningkatkan deteksi 2. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik 3. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik 4. Menstabilkan analit yang sensitif. Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UV-Vis sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di samping itu, juga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mamapu berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri. Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni: produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri; proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %); produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi; serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidakmenganggu pemisahan kromatografi. Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain : Gugus fungsional Reagen untuk dapat dideteksi dengan UV-Vis Reagen untuk dapat dideteksi dengan Fluoresen Asam-asam kaboksilat; asam-asam lemak;asam-asam fosfat p-nitrobenzil-N,N’-diisopropilisourea (PNBDI); 3,5-dinitrobenzil-N,N’-diisopropilisourea (DNBDI); p-bromofenasil bromida (PBPB) 4-bromometil-7-asetoksikumarin; 4-bromometil-7-metoksikumarin; Alkohol 3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC); 4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1). Aldehid; keton p-nitrobenziloksiamin hidroklorida (PNBA); 3,5-dinitrobenziloksiamin hidroklorida (DNBA); Dansil hidrazin Amin primer Fluoresamin o-ftalaldehid (OPA) Amin primer (1o) dan sekunder (2o) 3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC); N-suksinimidil-p-nitrofenilasetat (SNPA); N-suksinimidil-3,5-dinitrofenilasetat (SDNPA); 4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1). 7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-F); Dansil klorida Asam-asam amino (peptida) 4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsil-Cl) Fluoresamin o-ftalaldehid (OPA) 7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-F); Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column derivatization) atau setelah analit keluar dari kolom (post-column derivatization). B. SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY Size exclusion chromatography, atau yang dikenal juga dengan gel permeation atau filtration chromatography biasa digunakan untuk memisahkan dan memurnikan protein. Metode ini tidak melibatkan berbagai macam penyerapan dan sangat cepat. Perangkat kromatografi berupa gel berpori yang dapat memisahkan molekul besar dan molekul kecil. Molekul besar akan terelusi terlebih dahulu karena molekul tersebut tidak dapat penetrasi pada pori-pori. Pemisahan berbagai konstituen dengan meninjau perbedaann ukuran dan geometri molekul adalah dasar Kromatografi eksklusi. Peredaan ukuran menyebabkan beberapa partikel bergerak lebih cepat ddaari yang lainya sehingga menimbulkaan perbedan permukaan migrasi. Kromatografi eksklusi dapat dikelompokkan menjadi tiga kategori yaitu : a) Teknik permeasi gel atau filtrasi gel, b) Eksklus dan reterdasi ion c) Inorganic molecular sieves A. Teknik Permeasi atau Filtrasi Gel Teknik permeasi atau Filtrasi adalah suatu teknik yang menguraikan campuran zat-zat sesuai dengan ukuran molekulnya. Teknik ini didasari atas inklusi dan eksklusi suatu zat terlarut melalui suatu fase diam yang terbuat dari gel polimer yang terikat silang ddan berpori heterogen. Dalam kromatografi eksklusi cair-padat pemisahan teradi antara vase cair di dalam partike gel dan cairan di luar mengelilingi partikel gel. Sebagai penunjang fase diam dalam pemisahan ini biasanya digunakan xerogel-xerogel. Xerogel adalah suatu gel organik yang dapat bersifat hidrofilik (yaitu : agar dan dekstran yang terikat silang pada poliakrilamida) ataupun hidrofobik (poistirena). Xerogel-xerogel ini tersedia di pasaran dengan nama dagang biogel p-2 (poliakrilamida),sepadex G-10-200 (dekstran) juga styrogel (gel polistirena yang dimodifikasi) dan agarose. Kolom yang digunakan adalah kolom biaya pengelusi (luent) dibiarkan mengalir karena grafitasinya. Laju aliran akan bertambah dengan bertambahnya ukuran partikel seperti kromatografi pertukaran ion, laju aliran juga dapat dipengaruhi oleh variasi porositas gel. Untuk suatu gel yang tidak padat, volume interstisi dapat diturukan dengan pemberian tekanan, volume eluent berkisar antara 25 – 100 ml. sepertii juga metode kromatografi lainnya, konsekwensi efluaennya diukur melalui sifat-sifat fisik yang sesuai seperti indeks refraksi, absorbansi,, intensitaas pendar flour atau sifat-sifat listriknya. Parameter-parameter kolom dapat dihubungkan secar matematik dengan Vb = Vo + Vi + Vr = Vo Vs Vi = m Sr/ Ps Vi =Vo + Kd Vi Dimana : Vi = volume bagiana dalam gel Vr = volume matriks gel Vs = volume total face diam gel m = berat gel Sr = volume pelarut yang dipakai Ps = kerapatan pelarut Kd = koefisien distribusi Pr = kerapatan gel Vb = volume bed Vo = volume di luar gel Pemisahann suatu tipe gel bergantung pada ukurran molekul dan sifat kimia dari zat yang akan dipisahkan. Misalkan biogel 0 – 10 digunakan untuk zat-zat dengan berat molekul berkisar antara 500-17000 satuan. Molekul dengan besar molekul diatas batas ini yaitu limit eksklusif, akan lewat saja tanpa rintangan dari gel. Di bawah limit eksklusi, zat tersebut akan terelusi pada volume elusi yang sesuai dengan volume bed total. Untuk bekerja dalam medium tidak berai, gel yang tepat digunakan adalah sephadex LH-20. Pemakain Kromatografi permeasi gel digunakan untuk analisis campran molekul dengan berat molkul yang berbeda seperti pemisahaan rafinosa, maltose, dengan menggunakan sephadex pada pH 7,0, laju aliran 5 ml/jam ddan H2O sebagai eluent. Pemisahan molekul- molekul dengan berat molekul sama dapat juga dilakukan dengan pemilihan yang tepat tipe gel dan tinggi kolomnya. Pengeluaran garam (desalting) adalah salah satu pemisahan yang meliputi pembebasan garam dan senyawa berberat dengan molekul makro. B. Eksklusi dan reterdarsi ion Eksklusi ion adalah suatu proses untuk memisahkan materi ionic dari materi nonionic didasari pada perbedaan distribusi pada ke dua tipe zat pelarut ini di antara vase resin penukar ion dan larutan air. Jika suatu resin penukar ion diletakkan dalam larutan elektrolit encer atau dalam air, konsentrasi elektrolit pada kesetimbangan dalam fase resin akan lebih kecil dari pada larutan sekelilingnya yaitu fase luarnya, tetapi bila resin diletakkan dalam suatu larutan nondielektrolit (dalam air), maka nonelektrolit ini akan berubah untuk terdistribbusi secara merata pada kedua fase. Jadi sebenarnya tidak terjadi penukaran ion dalam peristiwa absobsi elektrolit dan elektrolit tersebut. Karena ke dua tipe zat terlarut ini dapat diekstraksi dari resin dengan hanya mengencerkan larutan laurnya (sekelilingnya). Dengan air. Jiak suatu latutan yang mengandung baik materi-materi ionic dan nonionic diletakkan pada bagian atas kolom berisi resin dan dicuci dengan air, materi ionic akan mengalir mengelilingi partikel resin sedang materi nonionic berdifusi kedalam pertikel-partikel resin dan masuk kedalam rongga-rongga kosong antara partikel resin. Laju perpindahan materi nonionic akiabatnya akan lebih rendah dari pada komponen ionicnya dan akan teramati komponen ionic muncul terlebih dahulu sebagai efluen. Jelasbahwa resin penukaran ion digunakan sebagai fase diam, dank arena tidak terjadi penukaran ion, resindapat dipakai terus-menerustanpa regenerasi. • Mekanisme Eksklusi Ion Suatu resin penukaran ion tidaklah sama dengan absobsi biasa. Dengan mengatur jaringan muatan suatu resin, dapat diperoleh keadaan dimana hanya satu macam ion elektrolit yang dieksklusikan. Jumlah total elektrolit yang berdifusi kedalam resin dibatasi eloh prinsip elektronetralitas. Makin kuat terionisasi suatu resin penukaran makin efesien untuk eksklusi ion. Banyaknya garam yang erdifusi kedalam resin berkurang dengan bertamnbahnya kapasitas penukar ion suatu resin. Sebagian besar ion elektrolit berberat elektrolit rendah yang mudah larut dalam air, bebas berdifusi kedalam dan keluar resin tidak peduli besarnya kapasitas resin, sehingga cenderung berkonsentrasi sama dengan ke dua fase saat kesetimbangan tercapai. • Aplikasi Metode Ion Eksklusi Gula dan garam tidak dapat dipisahkan dengan metode ini karena ukuran dan ketidakmampuanya relative dari molekul sukrosa dan glukosa untuk berdifusi secara cepat kedalam fase resin. Pemisahan elektrolit kuat dan molekul netral paling baik dicapai dengan metode eksklusi ion, misalnya pemisahan NaCl dan etilen glikol, HCl dan HC3COOH, CH3COOH; NaCl dan etano. Riechenberg telah menggunakan teknik ini untuk pemisahan anggota deret Homolog, misalkan pemisahan asam asetat dan asam n- butirat. Gugusan sulfanat yang bersiafat asam pada resin penukaran ion, dapat menghasilkan efek garam pada materi organic dan cenderung untuk menehan efek absorbsi matriks resin. Oleh karena itu rieman menggunakan larutan garam sebagai pengganti larutan H2O untuk eluen dalam memisahkan methanol, etanol dan propanol. Efek yang menguntungkan adanya garam dalam eluen adalah efek garam selektif terhadap komponen nonionic dari fase larutannya. C. Molekular sieve anorganic – Zeolit Zeolit alam dan sintesis membentuk suatu saringan molekul untuk pemisahan gas-gas dan molekul organic berukuran organic berukuran kecil. Volume suatu zeolit terbentuk dari suatu rongga-romgga yang saling dihungbungkan dengan saluran-saluran (channels). Penyaringan dan aksi penghambatan dari saluran dikombinasikan dengan aktifitas adsobsi permukaan matriks Kristal sehingga memungkinkan digunakannya zeolit untuk memisahkan molekul—molekul yang lebih kecil dari ukuran saluran ini dari molekul yang lebih besar ukurannya dari ukuran saluran. Aktifitas permukaan dan geometris molecular berperanan dalam pemisahan ini. Secara structural zeolit adalah rangka tetrahedral yang bersatu membetuk struktur sarang tawon dengan rongga-rongga besar yang saling berhubungan melalui saluran-saluran kecil. Penampang lintang dari saluran inilah yang menentukan ukuran molekul yang dapat masuk ke dalam rongga-rongga. Ukuran dari posisi ion logam (misal Na, Ca) dalam Kristal zeolit,dan tipe struktur jaringan rangka tetra hedral alumina silica zeolit menentukan diameter efektif dari saluran-saluran tersebut. Beberapa macam tipe zeolit, misalkan tipe molecular sieve 4A adalah [Na12 (AlO2)12 (SiO2)12]. Molekul berdiameter lebih kecil dari 4A akan terabsorbsi, misalkan H2O, CO2, H2S, SO2dan hidrokarbon borongga 1-2 atom karbon. Etana dapat masuk kedalam molecular sieve 5A, yang dibuat dari molecular sieve 4A dengan menggantikan Na oleh Ca dan K. paraffin lantai lurus dapat masuk kedalamnya, demikian juga alcohol sampai dengan C 4, tetapi siklopropana tidak dapat masuk. Demikian juga asam naftanik dan olekul aromatic lainya. Tipe 10 x dan 13 x adalah Na8 (AlO2)80 (SiO2)106. Mereka mengabsobsi molekul berdiameter sampai 10 A. Molecular sieve mempunyai afinitas lebih besar terhadap molekul polar dan senyawa yang berpolarisasi karena induksi pada molekul nonpolar yang berukuran sama. Molekul-molekul polar tertahan dengan kuat dalam rongga Kristal. Pada pemurnian dan industry gas, molekul sieve digunakan untuk menghilangkan molekul-molekul tidak jenuh (polar). Zeolit digunakan juga sebagai medium berlangsungnya reaksi. Bahan kimia didalamnya sebagai hasil reaksi dapat dikeluarkan dengan menggunakan teknik vakum atau dengan pergeseran menggunakan materi yang berabsorbsi kuat, misalkan air. Molecular sieve ini dapat diaktifkan kemali dengan peanasan 200-3500 C. mereka juga digunakan dalam kromatografi gas padat sebagai fase diamnya dalam kolom. C. REVERSE PHASE CHROMATOGRAPHY Reverse phase chromatography merupakan alat analitikal yang kuat dengan memadukan sifat hidrofobik serta rendahnya polaritas fase stasioner yang terikat secara kimia pada padatan inert seperti silika. Metode ini biasa digunakan untuk proses ekstraksi dan pemisahan senyawa yang tidak mudah menguap (non-volatile). Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan : a. Kromatografi fase normal Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar , misalnya silica gel, sedangkan fase geraknya bersifat non polar. b. Kromatografi fas terbalik Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fasegeraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal. Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom, adsorben silika gel harus senantiasa basahkarena, jika dibiarkan kering, kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak, sehingga prosespemisahan zat tidak berjalan optimal. Selain itu, kondisi yang senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom. Kromatografi fase balik merupakan kebalikan dari kromatografi fase normal. Kromatografi fase balik menggunakan fase diam yang bersifat nonpolar, dan fase geraknya yang relatif lebih polar daripada fase diam. Fase diam yang umum digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18). Hampir 90 % senyawa kimia dapat dianalisis dengan kromatografi jenis ini (Meyer, 2004; Kazakevich and Lobrutto, 2007). BAB III PENUTUP A. Kesimpulan a. Kromatografi cair (LC) adalah teknik pemisahan di mana fase gerak adalah cairan. kromatografi cair dapat dilakukan baik dalam kolom atau pesawat. kromatografi cair hari kini yang umumnya menggunakan kemasan partikel kecil yang sangat dan tekanan yang relatif tinggi disebut sebagai kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). b. Macam-macam kromatografi cair i. HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CROMATOGRAPH) ii. SEC (SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY) iii. RPC (REVERSE PHASE CHROMATOGRAPHY) B. Saran Demikian makalah ini di susun, tentunya banyak kekurangan baik dalam segi isi atau penyampaiannya. Oleh karena itu, saya mengharap kritik dan saran demi kesempurnaan makalah kami. Semoga makalah ini bermanfaat bagi pembaca. Penulis juga berharap kromatografi gas yang telah disajikan dalam bab pembahasan dapat dijadikan referensi ataupun tambahan wawasan bagi pembaca sehingga dapat membedakannya dan dapat menerapkannya secara tepat.   DAFTAR PUSTAKA Settle, F (Editor), 1997, Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry, Prentice Hall PTR, New Jersey, USA. Meyer, F.R., 2004, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4th Ed., John Wiley & Sons, New York. Kealey, D and Haines, P.J., 2002, Instant Notes: Analytical Chemistry, BIOS Scientific Publishers Limited, New York. Kenkel, J., 2002, Analytical Chemistry for Technicians, 3th. Edition., CRC Press, U.S.A. Snyder, L. R., Kirkland, S.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method Development, John Wiley & Son, New York. Munson, J.W., 1981, Phrarmaceutical Analysis: Modern Methods, Part A and B, diterjemahkan oleh Harjana dan Soemadi, Airlangga University Press, Surabaya. Cserhati, T. And Forgacs, E., 1999, Chromatography in Food science and Technology, Technomic Publishing, Lancaster, Basel. Adnan, Mochamad. 1997. Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan. Yogyakarta: Andi Offset Sastrohamodjojo Harddjono Dr. Kromatografi. IPB Press. Bogor 1985 Soebagio, Drs Dkk, Kimia Analitik II, Jica Common Textbook, Malang 2002 Underwood, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga Jakarta. 2004   TUGAS MAKALAH ANALISIS INSTRUMEN JURUSAN FARMASI POLITEKNIK KESEHATAN MAKASSAR "PEMBAGIAN KROMATOGRAFI” DISUSUN OLEH : NAMA : Indah Resky Paingi (PO.71.3.251.11.1.070) Muliani (PO.71.3.251.11.1.079) Mutia Rahayu (PO.71.3.251.11.1.080) Theofilus (PO.71.3.251.11.1.096) Widyawati (PO.71.3.251.11.1.097) KELAS : Reg.B/2011 POLTEKKES KEMENKES MAKASSAR JURUSAN FARMASI 2011/2012